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生物样品超薄切片技术
与电镜观察（一）
——样品制备

一、超薄切片技术——为什么做超薄切片
超薄切片技术是生物电镜技术中最基本、应用最多的样品制备技术，也是一个电镜实验室存在与发展必备的基本技术。它不仅越来越广泛地应用于不同的模式生物、不同个体的发育阶段、不同个体的器官组织及不同生理和病理情况下的超微结构研究，而且也是不断发展的各种新技术的基础。它可以帮助科学家们更好地研究生物体的结构和功能。这种技术可以将生物体切成非常薄的切片，使得科学家们可以更加清晰地观察生物体的内部结构。
在本文中，我们将探讨超薄切片技术制备流程、常用固定剂的介绍以及它在生物学研究中的应用。透射电镜观察对样品的要求：

1、为了使电子束穿透样品，超薄切片的厚度通常为70nm左右，约等于红细胞直径的1%

2、在制样过程中，样品的超微结构必须得到完好的保存，应严格防止样品结构和性质发生改变以及样品遭受污染等，因此超薄切片室必须非常洁净；3、样品应牢 固地置于直径为3mm的专用载网上，以便能经受电子束的轰击，并防止在装卸过程中的机械振动而损坏；4、样品必须干燥且导电。
样品类型：
①材料样品：有机高分子材料和无机粉体材料、金属材料和其他无机材料高分子聚合物（如聚丙烯、高密度聚乙烯、尼龙等）；工业材料如聚合物（橡胶和塑料）以及韧性、硬质或脆性材料（金属或陶瓷）；
②生物样品：如细胞、组织、病毒、蛋白质等。

二、生物样品超薄切片技术——制样流程
1、取材：生物样品的采集亦称取材。对取材过程的基本要求是：确保样品尽可能接近自然生活状态，同时确保定位准确。注意生物样品的特殊性。
①定位准确——取材最重要的操作是定位准确，注意组织取材的极性和方向性。
②取材快捷——取材操作要快捷。样品在离体后以最快的速率浸入初固定液，以免长时间缺血缺氧引起组织细胞自溶，并防止微生物繁殖导致样品腐败，破坏精细结构。
③样品尺寸合适——对样品尺寸的限制主要是基于对固定液穿透能力的考虑，体积一般以约1mm³的为宜。 

                                                           A.接近正方体形状的样品颗粒，约1mmx1mmx1mm；

                                                           B.接近长方体形状的样品条，约1mmx1mmx3mm；

                                                           C.薄片状样品，约1mmx2mmx3mm。

④操作轻柔——轻柔的操作可减少人为机械损伤，尽量避免金属器具对组织细胞的夹持、挤压和牵拉。另外，组织细胞一定要用缓冲液清洗。
⑤温度合适——对于原位固定取材的组织、离体的新鲜组织或培养的细胞，缓冲液和固定液的温度应接近生理温度。取材后0.5 h左右可将固定的样品置入4℃冰箱保存。
2、固定：将新鲜的活组织从生物体取下后，立即投入固定剂中，借助化学药品的作用，使细胞保持原有形态和结构，更好地保存其超微结构。生物样品的固定技术包括化学固定与物理固定（冷冻固定）两大类。
固定剂的种类：
①醛类固定剂：醛类固定剂包括戊二醛、丙烯醛、甲醛、多聚甲醛等。
②四氧化锇固定液。
③其它固定液：包括高锰酸钾、四氧化钌、单宁酸等。

固定剂的主要作用是使蛋白质、脂质等生物大分子发生某种交联。理想的固定剂应使细中各种成分都得到良好固定，但实际上，至今还没有一种能够把细胞中的物质全部固定的全能固定剂，不同固定剂对细胞成分的固定具有选择性。

3、浸洗：醛类固定液固定后，组织中的残留醛易与四氧化锇反应产生细微的小颗粒沉淀，所以浸洗要彻底。浸洗液温度应大致与固定液温度相同。浸洗时间对不同的样品有不同的要求，但一般样品浸洗为2-3次，每次5-10min，并不是时间越长越好。

4、脱水：脱水是用有机溶剂逐渐将样品中游离水完全取代的过程，其最终的有机溶剂必须能较好地与水和包埋剂混溶。
脱水的目的：
①避免样品中的水分在镜筒高真空下汽化引起污染并破坏真空；
②包埋用试剂大都是非水溶性的，组织内存在的游离水会影响包埋剂的浸透；
③采用能与水和包埋剂混溶的有机溶剂替代其它脱水剂。

脱水剂：所有可以脱水的有机溶剂之总称，有乙醇、丙酮和环氧丙烷。电镜常用的脱水剂为乙醇和丙酮。
脱水步骤：30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、100%乙醇2次、100%丙酮2—3次（5—10 min/次）。

5、浸透：是用包埋剂逐渐取代组织中脱水剂，使细胞内外空隙被包埋剂填充。经过脱水的组织，先放入不同比例的包埋剂与脱水剂混合液中浸透，然后放入纯包埋剂中浸透，浸透时间根据不同样品和不同包埋剂确定。

6、包埋：是将浸透好的组织放在填有包埋剂的平板模具或胶囊中。然后，通过加热聚合将极小的组织固定在凝固的包埋剂中，得到样品包埋块，以便进行超薄切片。通常包埋剂分为环氧树脂类和水溶性树脂。

7、切片：制作超薄切片，需要使用专门的超薄切片机来完成。切片厚度一般为70nm左右，约等于红细胞直径的1%。超薄切片室必须非常洁净且相对封闭，进入之前要换干净的鞋子和工作服，尽可能减少人员往来走动。

8、染色：利用某些金属盐类与细胞中各种成分不同程度的结合的特性，对切片样品进行电子染色处理，增加图像的反差。常用染色剂有乙酸双氧铀、铅盐类染色剂（如柠檬酸铅）、高锰酸钾、硝酸镧、钌红等。
影响生物组织样品制备成功率最重要的是取材！！！
本文部分内容摘自《生命科学中的电子显微镜技术》高等教育出版社

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